بارکدهای نوکلئوتیدی متصل به RNA به طور منحصر به فردی ژن های تنظیم کننده را شناسایی می کنند – ScienceDaily


CRISPR-Cas9 برای تعیین تأثیر آن بر روی ارگانیسم یا سلول یا حتی ژن دیگری ، ناک اوت یا نیشگون گرفتن یک ژن را تسهیل می کند. اما اگر بتوانید همزمان چندین هزار آزمایش را انجام دهید ، با استفاده از CRISPR هر ژن را در ژنوم جداگانه تغییر دهید و سریع تأثیر هر یک را ببینید؟

تیمی از دانشگاه کالیفرنیا ، برکلی ، دانشمندان یک روش آسان برای این منظور ایجاد کرده اند که به هر کسی امکان می دهد از یک سلول ، از جمله سلولهای انسانی ، مشخصات خود را نشان دهد و به سرعت تمام توالی های DNA را در ژنوم که بیان ژن خاصی را تنظیم می کنند ، شناسایی کند.

اگرچه این روش برای محققان علاقه مند به ردیابی آبشار فعالیت ژنتیکی – شبکه ژنتیکی – که روی ژن مورد علاقه تأثیر می گذارد ، از مزایای ویژه ای برخوردار خواهد بود ، اما همچنین به محققان کمک می کند تا به سرعت توالی های نظارتی را پیدا کنند ژن های بیماری را کنترل کرده و احتمالاً اهداف دارویی جدیدی پیدا کنید.

نیکلاس اینگولیا ، استادیار پزشکی مولکولی و سلولی گفت: “بیماری که ممکن است بخواهید از این روش استفاده کنید ، سرطان است که در آن ژن های خاصی را می شناسیم که این سلول های سرطانی بیان می کنند و برای زنده ماندن و رشد باید بیان کنند.” زیست شناسی UC Berkeley. وی افزود: آنچه این ابزار به شما اجازه می دهد انجام دهید این است كه این س askال را بپرسید: ژن های بالادستی چیست ، تنظیم كننده هایی كه این ژن هایی را كه می شناسیم كنترل می كنند چیست؟

این کنترل کننده ها ممکن است برای هدف گذاری درمانی آسان تر باشند تا سلول های سرطانی را رد کنند.

تکنیک جدید کاری را که انجام آن تاکنون دشوار است ساده می کند: برای یافتن این کنترل کننده های نهایی به مسیرهای ژنتیکی سلول برگردید.

وی گفت: “ما راه های بسیار خوبی برای پیشبرد کار داریم.” “این یک روش خوب برای کار به عقب است ، برای درک آنچه قبل از چیزی است. من فکر می کنم بسیاری از برنامه های کاربردی بالقوه در تحقیقات بیماری وجود دارد.”

“بعضی اوقات از این قیاس استفاده می کنم که وقتی وارد اتاق تاریک می شویم و یک کلید روشن می کنیم ، می توانیم ببینیم چراغ روشن است. این نور مانند ژن است و وقتی سوئیچ را روشن می کنیم می توان ژن ها را روشن کرد. ما قبلاً بسیار خوب هستیم. در آن ، “او اضافه کرد. “آنچه به ما امکان می دهد عقب کار کنیم. اگر چراغ مورد علاقه ما باشد ، می خواهیم بدانیم کدام سوئیچ ها آن را کنترل می کنند. این راهی برای انجام این کار به ما می دهد.”

رایان مولر ، دانشجوی تحصیلات تکمیلی آزمایشگاه در اینگولیا و همکارانش لوکاس فرگوسن و زوریا میام ، به همراه اینگولیا ، جزئیات تکنیک خود را در تاریخ 10 دسامبر در مجله منتشر خواهند کرد. علوم پایه.

بارکد گذاری ژنوم

از زمان ظهور ویرایش ژن CRISPR-Cas9 هشت سال پیش ، محققانی که می خواهند عملکرد یک ژن خاص را تعیین کنند ، توانستند آن را دقیقاً با پروتئین Cas9 هدف قرار دهند و آن را از بین ببرند. با هدایت قطعه ای از RNA راهنما که مکمل DNA موجود در ژن است ، پروتئین Cas9 به ژن متصل شده و برش داده می شود یا مانند تداخل CRISPR (CRISPRi) آن را مهار می کند.

در خشن ترین نوع تجزیه و تحلیل ، سلول یا ارگانیسم یا زندگی می کند یا می میرد. با این حال ، می توان به دنبال اثرات ناک اوت ظریف تر ، مانند روشن یا خاموش بودن یک ژن خاص یا افزایش یا کاهش آن بود.

امروزه ، این نیاز به افزودن ژن گزارشگر دارد – غالباً ژنی که پروتئین فلورسنت سبز را رمزگذاری می کند – به یک کپی یکسان از پروموتر متصل است که بیان ژن مورد علاقه شما را آغاز می کند. از آنجا که پروموتر منحصر به فرد هر ژن زمان بیان آن ژن را تعیین می کند ، اگر ناک اوت Cas9 بر بیان ژن مورد علاقه شما تأثیر بگذارد ، بر بیانگر گزارشگر نیز تأثیر می گذارد و باعث می شود این فرهنگ در زیر نور فلورسنت سبز شود.

با این وجود ، با وجود 6000 ژن در مخمر – و در مجموع 20،000 ژن در انسان – تغییر بزرگی در هر ژن و یافتن تأثیر آن بر یک گزارشگر فلورسنت یک کار بزرگ است.

وی گفت: “CRISPR مطالعه کلی کلیه ژن های موجود در ژنوم و اختلال آنها را تسهیل می کند ، اما سوال اصلی این است که چگونه اثرات هر یک از این اختلالات را می خوانید؟”

این روش جدید ، که اینگولیا آن را تداخل CRISPR با توالی گزارشگر بارکد یا CiBER-seq می نامد ، با اجازه دادن به این آزمایش ها به طور همزمان و با ترکیب ده ها هزار آزمایش CRISPR ، این مشکل را حل می کند. این روش فلورسانس را از بین می برد و از توالی عمیق برای اندازه گیری مستقیم افزایش یا کاهش فعالیت ژن در استخر استفاده می کند. تعیین توالی عمیق از فناوری بعدی برای تعیین توالی از نسل بعدی و با کارایی بالا استفاده می کند و اساساً تمام ژن های بیان شده در نمونه های جمع شده را در نظر می گیرد.

“در یک آزمایش CiBER-seq ترکیبی ، ما می توانیم همه تنظیم کننده های بالادست را برای چندین ژن هدف مختلف در یک روز پیدا کنیم ، در حالی که اگر شما مجبور به استفاده از یک روش مبتنی بر فلورسانس باشید ، هر یک از این اهداف چندین روز از زمان اندازه گیری شما می گیرند” گفت اینگولیا.

CRISPR به طور موازی برای تولید هر ژن در بدن آسان است ، به لطف شرکتهایی که RNA تک آماده را برای استفاده با پروتئین Cas9 می فروشند. محققان می توانند sgRNA برای هر ژن در ژنوم و برای هر ژن دوازده sgRNA مختلف سفارش دهند – بیشتر ژن ها رشته های هزاران نوکلئوتید هستند ، در حالی که طول sgRNA ها حدود 20 نوکلئوتید است.

نوآوری کلیدی این تیم پیوند دادن هر sgRNA به یک توالی نوکلئوتیدی تصادفی منحصر به فرد بود – اساساً یک بارکد – مرتبط با یک پروموتر که فقط در صورت درگیر شدن ژن مورد علاقه ، بارکد را رونویسی می کند. هر بارکد با هدف قرار دادن جداگانه یک ژن از یک استخر پیچیده از هزاران sgRNA ، اثر یک sgRNA را در نظر می گیرد. تعیین توالی عمیق به شما فراوانی نسبی هر بارکد در نمونه را می گوید – برای مخمر ، حدود 60،000 – که به شما امکان می دهد به سرعت تعیین کنید که کدام یک از 6000 ژن موجود در مخمر بر روی پروموتر تأثیر دارد و در نتیجه ، ژن مورد علاقه شماست. برای سلولهای انسانی ، محقق می تواند بیش از 200000 RNA مختلف را هدف قرار دهد و هر ژن را چندین بار هدف قرار دهد.

“این در واقع همان کاری است که ما توانسته ایم متفاوت انجام دهیم: این ایده که شما یک کتابخانه بزرگ از RNA های مختلف هدایت کننده دارید ، که هرکدام ژنی متفاوت را مختل می کنند ، اما همان پروموترهای درخواست را روی خود دارند – پاسخی که شما مطالعه می کنید وی گفت: این سازمان دهنده پرسش باركد تصادفی را كه با هر راهنما مرتبط می كنیم رونویسی می كند. “اگر پاسخی برای شما جالب باشد ، هر ژن مختلف را در ژنوم فرو می برید و می بینید كه جواب چگونه تغییر می كند.”

به عنوان مثال اگر بارکدی دریافت کنید که 10 برابر بیشتر از بقیه باشد ، به شما می گوید که این پروموتر مورد نیاز 10 برابر با شدت بیشتری در این سلول گنجانده شده است. در عمل ، اینگولیا به عنوان یک بررسی چهار برابری ، به هر RNA راهنما حدود چهار بارکد مختلف متصل کرد.

وی گفت: “با نگاه مستقیم تر به پاسخ بیان ژن ، می توان بسیاری از ظرافت ها را در مورد خود فیزیولوژی ، آنچه در داخل سلول اتفاق می افتد ، درک کرد.”

در آزمایش های اخیراً گزارش شده ، تیم 5 ژن جداگانه در مخمر را آزمایش کرد ، از جمله ژن های درگیر در متابولیسم ، تقسیم سلول و پاسخ سلول به استرس. اگرچه ممکن است آزمایش همزمان 100 ژن با CRISPRing کل ژنوم امکان پذیر باشد ، وی گمان می کند که برای راحتی کار ، محققان خود را به چهار یا پنج بار در هر زمان محدود می کنند.

بودجه کار توسط انستیتوی ملی بهداشت (DP2 CA195768 ، R01 GM130996) تأمین می شود.


منبع: unbox-news.ir

Leave a reply

You may use these HTML tags and attributes: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>